多光子技术是基于多光子激发理论提出的新型光子技术。 双光子激发( two-photon excitation, TPE)是最简单的多光子激发( multi-photon excitation, MPE)过程。双光子激发理论最早由Goppert-Mayer于20世纪30 年代提出, 1961 年得到了实验验证。 1990年, Denk等将双光子激发用于荧光激发系统,制造出了双光子扫描显微镜,并应用于生物学观测。 1997年,美国伯乐( Bio-Rad)公司首次制造出商业化的多光子显微镜。双光子激光扫描显微镜( tw o-pho to n laser sca nning micro scopy ,TPLSM)一经问世,很快被应用于神经信号传导、生物代谢过程及其药物研究等生物学研究领域,取得了一系列显著成果。 目前,以双光子技术为代表的多光子技术已经在生物及医学成像、单分子探测、三维信息存储、微加工等领域得到广泛应用,展示了广阔的发展前景。 多光子激发基本物理原理 通常情况下,一个分子或者原子每次只能吸收一个光子 ,从基态跃迁到激发态。当光强足够高时,就会产生多光子跃迁,即一次可以吸收多个光子。以荧光物质的双光子吸收为例:荧光分子同时吸收两个相同频率的光子 ,被激发至高能级,经过一个弛豫过程后发生自发跃迁,辐射出一频率略小于两倍入射光频率的荧光光子。由此推出: 1,荧光分子的多光子激发需要的激光波长比单光子长。例如 ,双光子激发需要的激光波长大约是单光子激发所需激光波长的一倍。因此多光子激发能够用红外或者近红外光代替紫外光作为激发光源。 2,多光子激发只产生在焦点附近的一个极小区域中。对于聚焦光束产生的对角锥形激光分布,多光子激发被限制在焦点附近的一个极小区域中,从而实现“点成像”,具有固有的三维成像能力,这是多光子激发的一个基本特点。而单光子激发区域为两个锥形区,在整个照明区均产生荧光。 多光子激发成像技术特点 Periasamy 和 Skoglund 等比较了相同光学配置下,双光子激光扫描显微镜和共聚焦扫描显微镜对非洲蟾蜍囊胚以及神经轴胚体细胞的成像能力。研究结果表明,双光子激发成像穿透深度大、受细胞的固有荧光影响小。因而 ,双光子提供了研究细胞内动力学、物质空间分布及结构的最佳方法。 与荧光显微镜、共聚焦显微镜相比,多光子激光扫描显微镜具有以下特点: (1)对生物样品的光损伤小。克服了共聚焦显微镜在活体细胞和组织观测中的主要缺陷,减少了焦点外的光学伤害和背景光强度,极大地降低了紫外光对生物体正常生理活动的破坏和影响,为活体观测和研究提供了有利条件。 (2)有效观测时间长。荧光染料的光致漂白(即染料分子会因激发次数过多结构受到破坏而失效)是制约实验观测、影响实验结果准确性的主要因素之一。对于共聚焦显微镜,由于整个激光照射区域内的染料分子都会被激发 ,导致非焦点区域的染料过早漂白。而双光子激发只产生在焦点附近的一个极小区域中,从而大大减少了对非观测区荧光染料的破坏 ,使实验能够在保持生物体活性的前提下长时间进行。 (3)穿透深度深。生物体 (细胞、组织等)一般都是高散射体。由于散射系数反比于入射光波长的四次方,多 (N )光子成像将散射系数减弱到原来的 1 /N4,使大部分入射光强能到达样品焦平面 ,提高了穿透深度,有利于获取深层次组织的清晰荧光图像。 (4)荧光收集率高。与共聚焦成像相比,双光子成像不需要光学滤波器 (针孔 ) ,提高了荧光收集率。收集效率提高直接导致图像对比度提高。而共聚焦显微镜受到小孔限制 ,如果想提高收集效率,就需要扩大孔宽度,而这将导致分辨率下降,反之亦然。 (5)对探测光路的要求低。由于激发光与发射荧光的波长差值加大以及自发的三维滤波效果,多光子显微镜对光路收集系统的要求比共聚焦显微镜低得多,光学系统相对简单。 (6)适合多标记复合测量。许多染料荧光探针的多光子激发光谱要比单光子激发谱宽阔,这样,可以利用单一波长的激发光同时激发多种染料,从而得到同一生命现象中的不同信息,便于相互对照、补充。例如, EGFP和 DsRed 的单光子激发波长分别为 488 nm和 568 nm,无法实现利用一束单波长激光同时激发。Jakobs等利用双光子技术,用 925 nm激光同时激发了两种荧光蛋白,观察了它们在Escherichia coli 内的表达情况。 多光子激发扫描系统的局限 由于多光子技术的发展时间短,技术本身也存在一些局限。 (1)只能对荧光成像; (2)由于红外和近红外光源的使用,样品可能受到热损伤; (3)分辨率略有降低; (4) 受昂贵的超快激光器限制,目前多光子扫描显微镜的成本较高。 多光子技术的应用研究进展 多光子激光扫描显微镜是在激光共聚焦扫描显微镜基础上发展起来的。继1997年伯乐公司推出了第一台双光子激光扫描显微镜后,1998年5月德国莱卡公司也加入竞争。多光子扫描显微镜具有成像穿透深度深、光学三维分辨率高等特点,为实时、原位观察生物活体提供了最佳方法。 钙生物学研究 与荧光探针技术相结合 ,多光子显微镜可以对细胞内的钙离子动态过程进行实时监测、对钙离子浓度进行准确测量。多光子可以实现钙离子探针与其他荧光染料的复合测量 ,研究钙波、钙振荡现象同其他信号转导过程的联系 ,使对钙信号的研究从亚细胞层次深入到分子水平。 神经学研究 在神经学研究中,Rose等首次用双光子激发对海马趾神经刺和锥状神经树中钠离子进行了瞬时动态测量. Cox用双光子显微镜证明了动作电位能够影响神经轴,导致能够引起神经递质释放和目标神经突触激活的钙离子内流。 胚胎学与组织学研究 胚胎发育本身包含复杂的生命信息,对外界条件十分敏感。共聚焦显微成像往往妨碍胚胎发育,不能得到胚胎正常发育的信息。多光子成像非常适合胚胎发育的长期动态跟踪。 分子生物学研究 利用某些报告基因,多光子成像可以在不破碎细胞前提下显示基因在生物体内的表达,已广泛应用于基因转染和表达研究。 代谢过程研究 多光子技术可以用来对标记物质的代谢过程进行监测,记录代谢物的分布、代谢速度,从而突破传统的生物化学分析方法,从单个细胞层次实时研究代谢过程,已应用于药物、糖类等物质的代谢研究。 笼锁化合物的定点释放 许多重要的生物物质都有其笼锁化合物。处于笼锁化合物状态的生物物质功能被封闭;特定波长的光可以使其光解笼锁,恢复活性和功能;人为的控制笼锁化合物的定点、定时释放 ,便于研究生物物质的代谢过程 ,并根据治疗、发育的要求进行人工操控。 对生物体内某些物质的定点操控 除了对笼锁化合物释放的控制,多光子技术可以方便地用于对细胞或者组织内某些物质的定点操控。 免责声明:编写或转载此文是为了传递更多的信息,为光电行业尽一些绵薄之力。若文字或图片侵犯了您的合法权益或有不当之处,请作者在20个工作日之内与我们联系,我们将协调给予处理。 联系邮箱:lm@focaloptics.com,欢迎相关行业朋友与我们约稿。谢谢。 |
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